Menetelmät

Geenidiagnostiikassa käytetään yleiseti kaupallisesti saatavissa olevia reagensseja ja laitteita. Kaikki käyttämämme menetelmät on myös laboratoriossa testattu ja validoitu soveltuviksi diagnostiseen käyttöön. Menetelmien suorituskykyää seurataan jatkuvasti mm. hyödyntämällä kaupallisia kontrollinäytteitä (NGS) ja osallistumalla ulkoisiin laaduntarkkailukierroksiin säännöllisesti (TaqMan, MLPA).

DNA:n eristys

Genominen DNA eristetään EDTA-verestä QIAamp® DNA Blood -kitillä (Qiagen) Menetelmä sopii sekä tuoreelle että pakastetulle verelle. Eristetyn DNA:n puhtaus, laatu ja pitoisuus tarkastetaan fotometrisesti ja/tai fluorometrisesti ennen geneettisiä analyysejä.

TaqMan®-menetelmä

Valtamutaatiot analysoidaan qPCR menetelmällä käyttäen TaqMan-kemiaa (Thermo Fisher Scientific). TaqMan®-menetelmää varten jokaiselle analysoitavalle variantille on suunniteltu spesifiset alukkeet ja koettimet. Suunnitteluprosessissa sekvenssistä on eliminoitu kaikki tunnetut sekvenssimuutokset ja yleiset toistojaksot. Näin estetään tutkittavan variantin läheisyydessä olevien muiden sekvenssimuutosten vaikutus analyysitulokseen. TaqMan®-menetelmä soveltuu ennalta tunnettujen yhden nukleotidin muutosten sekä lyhyiden insertioiden ja deleetioiden analysoimiseen. 

Sangerin sekvensointimenetelmä

Tutkittavan geenin koodaavat eksonialueet monistetaan PCR-menetelmällä ja analysoidaan kapillaarisekvensoinnilla käyttäen Sangerin sekvensointimenetelmää (Thermo Fisher Scientific). Eksonialueiden monistamisessa käytettävien alukkeiden suunnittelussa otetaan huomioon tunnetut sekvenssimuutokset ja yleiset toistojaksot sekä muut monistumiseen mahdollisesti vaikuttavat tekijät. Sangerin sekvensointimenetelmä soveltuu yhden nukleotidin muutosten sekä lyhyiden insertioiden ja deleetioiden analysoimiseen.

Uuden sukupolven sekvensointi

Uuden sukupolven sekvensoinnit (Next Generation Sequencing, NGS) suoritetaan Illuminan laitteilla, jotka käyttävät Sequencing by Synthesis (SBS) -kemiaa. NGS-sekvensoinnilla sekvensoidaan kohdistetusti tarjottujen geenipaneelien sisältämien geenien eksonialueet (UCSC hg19). NGS-sekvensointi perustuu massiiviseen rinnakkaissekvensointiin, jossa miljoonia lyhyitä DNA-fragmentteja monistetaan samanaikaisesti. Sekvensoidut fragmentit rinnastetaan ihmisen referenssisekvenssiin, jolloin siitä poikkeavat emäkset voidaan tunnistaa. Geenipaneelien sekvensointiin näytteet valmistetaan kaupallisilla kiteillä, joilla genominen DNA pilkotaan ja halutuilta genomin alueilta peräisin olevat fragmentit rikastetaan NGS-sekvensointia varten. Menetelmä soveltuu  yhden nukleotidin muutosten sekä lyhyiden insertioiden ja deleetioiden analysoimiseen. Tutkimusvastauksessa ilmoitetaan suoritetun sekvensoinnin keskimääräinen lukusyvyys sekä kattavuus (%>15x).

MLPA-menetelmä

Deleetioanalyysit tehdään kapillaarisekvensointilaitteella kaupallisella Multiplex-PCR-menetelmään pohjautuvalla kitillä (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA®) (MRC-Holland). MLPA-menetelmän käyttö deleetioanalytiikassa perustuu tutkittavan geenin eksonien kopioluvun määrittämiseen.

Tulosten tulkinta

Sekvensoinnissa ja deleetioanalytiikassa havaittuja sekvenssimuutoksia verrataan kirjallisuudesta löytyviin aikaisemmin raportoituihin sekvenssimuutoksiin niiden kausaalisuuden arvioimiseksi. Neutraaleiksi arvioituja havaittuja sekvenssimuutoksia ei raportoida. TaqMan-analyysillä tutkittavat mutaatiot ovat aiemmin kirjallisuudessa todettu kausaalisiksi. Tutkimustuloksesta toimitetaan lausunto hoitavalle lääkärille.