Menetelmät

Geenidiagnostiikassa käytetään yleisesti kaupallisesti saatavissa olevia reagensseja ja laitteita. Kaikki käyttämämme menetelmät on myös laboratoriossa testattu ja validoitu soveltuviksi diagnostiseen käyttöön. Menetelmien suorituskykyä seurataan jatkuvasti mm. hyödyntämällä kaupallisia kontrollinäytteitä (NGS) ja osallistumalla ulkoisiin laaduntarkkailukierroksiin säännöllisesti (TaqMan, MLPA).
Analyysit perustuvat RefSeq-tietokannan (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/) ihmisen genomin proteiinia koodaaviin alueisiin ja ne kattavat joko LRG (https://www.lrg-sequence.org/) tai Refseq-geenien transkriptit.

DNA:n eristys

Genominen DNA eristetään EDTA-verestä QIAamp® DNA Blood -kitillä (Qiagen) Menetelmä sopii sekä tuoreelle että pakastetulle verelle. Eristetyn kaksijuosteisen genomisen DNA:n puhtaus, laatu ja pitoisuus tarkastetaan fluorometrisesti ennen geneettisiä analyysejä.

TaqMan®-menetelmä

Valtavariantit analysoidaan käyttäen TaqMan-kemiaa (Thermo Fisher Scientific). TaqMan®-menetelmää varten jokaiselle analysoitavalle variantille on suunniteltu spesifiset alukkeet ja koettimet.
Suunnitteluprosessissa huomioidaan toistojaksot ja tunnetut sekvenssimuutokset, jolla estetään näiden vaikutus analyysitulokseen. Tämä ei kuitenkaan poista raportoimattomien harvinaisten muutoksien aiheuttamia vaikutuksia.
TaqMan®-menetelmä soveltuu ennalta tunnettujen yhden nukleotidin muutosten sekä lyhyiden insertioiden ja deleetioiden analysoimiseen.

Sangerin sekvensointimenetelmä

Tutkittavat alueet monistetaan PCR-menetelmällä ja analysoidaan kapillaarisekvensoinnilla käyttäen Sangerin sekvensointimenetelmää (Thermo Fisher Scientific). PCR-monistuksessa käytettävien alukkeiden suunnittelussa otetaan huomioon toistojaksot ja tunnetut sekvenssimuutokset sekä muut monistumiseen mahdollisesti vaikuttavat tekijät. Sangerin sekvensointimenetelmä soveltuu yhden nukleotidin muutosten sekä lyhyiden insertioiden ja deleetioiden analysoimiseen.

Uuden sukupolven sekvensointi

Uuden sukupolven sekvensoinnit (Next Generation Sequencing, NGS) suoritetaan Illuminan laitteilla, jotka käyttävät Sequencing by Synthesis (SBS) -kemiaa. NGS-sekvensoinnilla sekvensoidaan kohdistetusti tarjottujen geenipaneelien sisältämien geenien eksoni- ja eksonien reuna-alueet (vähintään 5 emästä) (UCSC hg19). NGS-sekvensointi perustuu massiiviseen rinnakkaissekvensointiin, jossa miljoonia lyhyitä DNA-fragmentteja monistetaan samanaikaisesti. Sekvensoidut fragmentit rinnastetaan ihmisen referenssisekvenssiin, jolloin siitä poikkeavat emäkset voidaan tunnistaa. Geenipaneelien sekvensointiin näytteet valmistetaan kaupallisilla kiteillä, joilla genominen DNA pilkotaan ja halutuilta genomin alueilta peräisin olevat fragmentit rikastetaan NGS-sekvensointia varten. Menetelmä soveltuu yhden nukleotidin muutosten sekä lyhyiden insertioiden ja deleetioiden analysoimiseen. Tutkimusvastauksessa ilmoitetaan suoritetun sekvensoinnin keskimääräinen lukusyvyys sekä kattavuusprosentti vähintään 15-kertaisella lukusyvyydellä (%>15x).

MLPA-menetelmä

MLPA-menetelmän käyttö deleetioanalytiikassa perustuu tutkittavan geenin eksonien kopioluvun tai tunnettujen varianttien genotyypin määrittämiseen. Deleetioanalyysit tehdään kapillaarisekvensointilaitteella kaupallisella Multiplex-PCR-menetelmään pohjautuvalla kitillä (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA®, MRC-Holland). Analyysi soveltuu deleetioiden lisäksi tutkittavalla alueella esiintyvien muiden kopiolukumuutosten ja ennalta määritettyjen varianttien määrittämiseen.

Tulosten tulkinta

Sekvensoinnissa ja deleetioanalytiikassa havaittuja sekvenssimuutoksia verrataan tietokannoista ja kirjallisuudesta löytyviin aikaisemmin raportoituihin sekvenssimuutoksiin niiden kausaalisuuden arvioimiseksi. Variantit arvioidaan ACMG suositusten mukaisesti (Richards et al., 2015). Neutraaleiksi arvioituja havaittuja sekvenssimuutoksia ei raportoida. TaqMan-analyysillä tutkittavat mutaatiot ovat aiemmin kirjallisuudessa todettu kausaalisiksi. Tutkimustuloksesta toimitetaan lausunto hoitavalle lääkärille.

Viitteet

Richards, S., Aziz, N., Bale, S., Bick, D., Das, S., Gastier-Foster, J., Grody, W., Hegde, M., Lyon, E., Spector, E., Voelkerding, K. and Rehm, H. (2015). Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine, 17(5), pp.405-423.